细胞样本适当准备和固定以后，样本可被染色。所有的IHC/ICC实验都依赖于特异的抗体和表位之间的结合，该结合由疏水相互作用、离子相互作用、氢键和其它分子间力支配。但是，同样的引力也可导致非特异性染色，也就是一抗未与目标抗原表位的氨基酸结合。这是 IHC/ICC实验中经常发生的。挑战在于降低非特异性相互作用的同时，不削弱抗体和表位之间的结合能力。非特异性染色的原因包括一抗和二抗与血清蛋白相互作用、抗体与组织之间的离子相互作用以及能够影响到所使用的IHC检测系统的内源性分子的相互作用。这些问题可导致高背景，并且导致无法在适当的细胞位置显示感兴趣的抗原。这种染色问题可通过使用封闭试剂阻止非特异性相互作用来解决。在孵育一抗和样本之前进行这些步骤。
防止非特异性疏水互相作用
虽然疏水相互作用是抗体和表位的结合所必需的，但是这些因素也可促进非特异性的结合。大部分的蛋白由于几个氨基酸的中性侧链而具有某种程度的疏水性。用热灭活的正常血清或牛血清白蛋白（BSA）对组织进行孵育是用于减少非特异性疏水结合的常用方法。为防止与一抗或二抗之间，或与被染色的组织和细胞之间的相互作用，选择正常血清的种类很重要。譬如，在使用山羊来源的一抗不建议同时使用山羊血清作为封闭试剂。我们会推荐使用二抗来源宿主的血清或其它无关物种来源的血清。BSA和脱脂奶粉也常被用作阻断试剂。在一抗和二抗的稀释剂中通常含有这些试剂中的某一种。加入非离子型去污剂包括0.3% Triton X-100TM 或Tween 20TM也可以减少非特异性疏水相互作用。
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| 用血清阻断非特异性结合。 A.在石蜡包埋的人扁桃体组织中使用生物素化的抗人CD14亲和纯化的多克隆抗体(货号：BAF383）检测CD14。组织抗原修复使用了碱性抗原修复试剂盒(货号：CTS013）。组织染色使用了高灵敏度链霉亲和素和HRP的偶合物（HSS-HRP）和DAB，并用苏木精（蓝色）进行复染。B.在平行实验中，一抗体孵育前用动物血清在室温条件下对组织进行15分钟的封闭步骤，可见非特异性背景染色显着降低。R&D Systems所有细胞和组织染色试剂盒都包含HSS-HRP和动物封闭血清。 |
预防非特异性离子相互作用
如果抗体和目标组织有净相反电荷，离子相互作用能使非特异性背景染色。譬如，非特异性染色可能由于相对的羧基和氨基互相引力。此外，范德华力，即偶极分子之间的弱静电相互作用，也能有助于该现象。增加固定剂和（或）抗体稀释缓冲液的强度能减少离子相互作用。但是这种方法也对染色的特异性产生潜在的负面影响，因为抗体和表位之间的结合通常取决于离子力。由于单克隆抗体的单个表位特异性，相比于多克隆抗体，增加离子强度更容易损害单克隆的表现力。
内源酶干扰
显色检测方法常用偶合酶显示抗体和表位相互作用。当使用这种检测方法时，必须阻断内源性相同酶的活性。比如，使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的实验需要特定试剂以阻断非特异性信号。由3-10% H2O2配制的封闭试剂可用于防止内源性过氧化物酶作用于底物。用1 mM左旋咪唑可阻止从肠、肾、淋巴和其他组织来源的内源性碱性磷酸酶。AP的肠形式不受左旋咪唑的影响，但可用1%乙酸对其封闭。
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| 淬灭内源性过氧化物酶活性。A.未能在染色之前淬灭内源性过氧化酶活性导致了人肾脏组织切片的假阳性信号。组织使用抗山羊HRP-DAB细胞和组织染色试剂盒染色 (货号：CTS008；褐色)。B.同样的组织在染色之前室温下使用含3% H2O2的甲醇溶液处理15分钟，淬灭了内源性过氧化物酶活性。 |
内源性生物素的干扰
另外一个用于IHC/ICC实验的常用检测方法是将链霉结合到生物素化的一抗或二抗上。因此，在与亲和素孵育之前必须封闭组织的内源性过生物素。内源性生物素发现在多种组织，包括肝，肾，心脏，脑和肺等，对这些样品使用亲和素进行预孵育是封闭内源生物素的常规方法。之后样品必须用生物素来封闭在亲和素分子上的多余的生物素结合位点。在使用这些亲和素/生物素封闭步骤之后，样本就可以与一抗共同孵育了。
Triton X-100是DowChemical Corporation的商标
Tween是ICI Americas的商标